Western Blot實(shí)驗(yàn)流程

1、蛋白質(zhì)抽提

A、實(shí)驗(yàn)對象為組織樣品，取適量（250-500mg）新鮮組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白。

B、實(shí)驗(yàn)對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白。

2、蛋白質(zhì)定量

按KCTMBCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說明操作，測定樣品濃度。

3、變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)

將準(zhǔn)備好的樣品液和生物素標(biāo)記的蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)*個(gè)孔中，電泳分離蛋白。

4、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜或PVDF膜

5、膜的封閉和抗體孵育

A、膜在5％BSA溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。

B、封閉過的膜加入一級(jí)抗體室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。

C、加入HRP標(biāo)記的二級(jí)抗體以結(jié)合一級(jí)抗體及HRP標(biāo)記的抗生物素抗體以結(jié)合分子量標(biāo)準(zhǔn)，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測GAPDH含量。

6、結(jié)果檢測

化學(xué)發(fā)光法檢測，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用ImageJ分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。

7、數(shù)據(jù)分析

目的蛋白的灰度值除以內(nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對含量。

8、提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告

包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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